Um esquema altamente eficiente para preparação de bibliotecas a partir de um único

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13913 (2023) Citar este artigo

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Embora os métodos para sequenciação da preparação de bibliotecas a partir de ADN de cadeia dupla estejam bem estabelecidos, os métodos de ADN de cadeia simples (ssDNA) não foram bem estudados. Além disso, os métodos existentes têm limitações em eficiência e rendimento. Portanto, desenvolvemos um procedimento altamente eficiente para sequenciar a preparação de bibliotecas de ssDNA. Neste método, a primeira marcação do adaptador de ssDNA é realizada usando ligação de ssDNA (TACS) mediada por conector de adenilato assistida por desoxirribonucleotidil transferase terminal (TdT), que relatamos recentemente. Após a síntese da cadeia complementar usando o ssDNA marcado com adaptador, é realizada a marcação do segundo adaptador via topoisomerase I do vírus Vaccinia (VTopoI ou TOPO). Com etapas adicionais para degradação, repressão e remoção do dímero adaptador, o esquema TACS-TOPO proposto realiza a preparação da biblioteca de sequenciamento sem dímero adaptador a partir de amostras de ssDNA de 24 pg. O esquema TACS-TOPO foi aplicado com sucesso à análise de DNA livre de células com preparação de biblioteca livre de amplificação a partir de 50 µL de soro humano. Um esquema TACS-TOPO modificado também foi aplicado ao DNA extraído de ossos humanos antigos, trazendo de duas a oito vezes mais rendimentos de biblioteca do que aqueles que utilizam um protocolo convencional de preparação de biblioteca. Os procedimentos para preparar VTopoI e seu complexo com um adaptador de oligonucleotídeo de fita dupla também são descritos. No geral, o esquema TACS-TOPO proposto pode facilitar a análise de sequenciamento prática e sensível do ssDNA.

Embora muitos métodos eficientes estejam disponíveis para a preparação de bibliotecas de sequenciamento a partir de DNA de fita dupla (dsDNA) 1,2,3, métodos limitados são relatados para DNA de fita simples (ssDNA). Apenas três princípios principais para a preparação de bibliotecas de sequenciação a partir de ssDNA foram estabelecidos até à data. A primeira abordagem envolve a cauda homopolimérica mediada pela desoxirribonucleotidil transferase terminal (TdT) para a extremidade 3' do ssDNA; a cauda é então usada como local de preparação para converter o ssDNA alvo em dsDNA, que é seguido pela marcação do segundo adaptador com T4 DNA ligase4. A preparação de bibliotecas mediada por TdT é altamente eficiente e alguns fabricantes fornecem kits de preparação de bibliotecas baseados neste princípio. No entanto, uma cauda longa pode constituir um obstáculo para a análise de sequenciamento a jusante.

O segundo método é baseado na ligação do ssDNA catalisada pela RNA ligase, que une um adaptador 5'-fosforilado à extremidade 3' do ssDNA. Por exemplo, o grupo de Meyer estabeleceu um método baseado na CircLigase II5,6. Após a ligação do adaptador, o ssDNA é convertido em dsDNA, seguido pela segunda marcação do adaptador pela T4 DNA ligase. Embora a RNA ligase possa conectar duas moléculas de ssDNA, a eficiência da reação é limitada a menos de alguns por cento. Portanto, o rendimento da preparação da biblioteca utilizando RNA ligase é bastante limitado.

A terceira abordagem utiliza T4 DNA ligase para ligação de ssDNA. Um adaptador de fita dupla com um hexâmero aleatório de fita simples em uma extremidade é usado neste método. Se o hexâmero aleatório for hibridizado de forma compatível com a extremidade do ssDNA alvo, o corte na extremidade parcialmente de fita dupla do adaptador pode ser selado com DNA ligase de T4. Este procedimento baseado em ligadura esplintada é denominado ssDNA2.0 e apresenta eficiência superior ao método baseado em CircLigase II7. Embora ambos os métodos baseados em RNA ligase e T4 DNA ligase possam produzir conexões limpas com o ssDNA alvo, suas baixas eficiências na preparação da biblioteca ainda precisam ser abordadas.

Para melhorar a preparação da biblioteca de sequências a partir de ssDNA, desenvolvemos uma técnica para a marcação eficiente do adaptador de ssDNA, denominada ligação de DNA de fita simples (ss) (TACS) mediada por conector de adenilato assistida por desoxirribonucleotidil terminal . Na ligação TACS, o ssDNA alvo é primeiro acompanhado de alguns adenilatos usando TdT em um processo chamado ribotailing, seguido pela marcação do adaptador mediada por RNA ligase do ssDNA ribotailed. A ribotailing da extremidade 3' do ssDNA permite que ele se comporte como RNA, o que aumenta muito a eficiência de ligação do ssDNA das RNA ligases. Consequentemente, a ligação TACS permite a marcação do adaptador de mais de 80% da extremidade 3' do ssDNA8 alvo. Notavelmente, a reação de cauda do TdT com o ribonucleotídeo é autoinibida após a extensão de 1 a 3 nucleotídeos, o que resulta apenas em uma interrupção mínima da análise de sequenciamento a jusante.