Quantificando a atividade metabólica de Ascaris suum L3 usando redução de resazurina

Parasitas e Vetores volume 16, Número do artigo: 243 (2023) Citar este artigo

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As infecções por helmintos são um importante problema de saúde pública em humanos e têm um impacto ainda maior no bem-estar dos animais domésticos e do gado. As leituras atuais para ensaios de triagem de medicamentos anti-helmínticos são estágio de desenvolvimento, migração ou motilidade que pode ser subjetiva, trabalhosa e de baixo rendimento. O objetivo deste estudo foi aplicar e otimizar uma técnica fluorométrica utilizando resazurina para avaliar alterações na atividade metabólica de larvas de terceiro estágio (L3) de Ascaris suum, parasita de alta relevância econômica em suínos.

Ascaris suum L3 foram eclodidos mecanicamente a partir de ovos embrionados com 6 a 8 semanas e enriquecidos com gradiente de sacarose. O corante resazurina e A. suum L3 foram titulados em placas de microtitulação de 96 poços, e a atividade de redução da resazurina foi avaliada por fluorometria após 24 horas de incubação. A microscopia de fluorescência foi utilizada para localizar o local de redução da resazurina dentro das larvas. Finalmente, expusemos A. suum L3 a várias condições de estresse, incluindo calor, metanol e anti-helmínticos, e investigamos seu impacto no metabolismo larval através da atividade de redução da resazurina.

Mostramos que o corante não fluorescente resazurina é reduzido dentro do vital A. suum L3 a resorufina fluorescente e liberado no meio de cultura. Os parâmetros de ensaio ideais são 100–1000 L3 por poço, uma concentração de resazurina de 7,5 µg/ml e incubação a 37 °C/5% de CO2 durante 24 h. Uma bainha L2 intacta ao redor da L3 de A. suum impede completamente a captação de resazurina, enquanto na L3 desembainhada, o sinal de fluorescência mais intenso é observado ao longo do intestino médio larval. L3 expostos ao metanol ou ao calor apresentam uma diminuição gradual da atividade de redução da resazurina. Além disso, a exposição de 24 horas à ivermectina a 0,625 µM, ao mebendazol a 5 µM e ao tiabendazol de 10 a 100 µM diminuiu significativamente a atividade metabólica larval em 55%, 73% e 70% a 89%, respectivamente.

Juntos, nossos resultados mostram que tanto os estressores metabólicos quanto os medicamentos anti-helmínticos reduzem significativa e reprodutivelmente a atividade de redução da resazurina de A. suum L3, tornando o ensaio proposto um método sensível e fácil de usar para avaliar a atividade metabólica de A. suum L3 in vitro .

O controle de nematóides gastrointestinais depende principalmente da quimioterapia em humanos e animais. No entanto, tratamentos recorrentes e reinfecções, limitação das classes de medicamentos anti-helmínticos atualmente disponíveis [49], relatos crescentes de redução da eficácia dos medicamentos e evolução da resistência aos anti-helmínticos de primeira linha, como os benzimidazóis e a ivermectina, aumentam a conscientização sobre a importância da pesquisa de medicamentos anti-helmínticos [19, 22 , 30, 38]. A rápida descoberta de novos medicamentos contra helmintos transmitidos pelo solo (STHs) é dificultada principalmente pela falta de métodos objetivos de triagem de alto rendimento para avaliar a eficácia dos medicamentos [1, 20, 47].

A avaliação microscópica da motilidade e da morfologia domina os métodos atualmente utilizados para avaliar a eficácia de medicamentos em larvas. Essas abordagens em geral são demoradas, trabalhosas e propensas à subjetividade, portanto não são adequadas para triagem de alto rendimento. Dispositivos como o xCELLigence System [40] e o wMicroTracker System ™ [24, 37] foram validados para triagem de drogas de alto rendimento com Caenorhabditis elegans e algumas espécies de helmintos parasitas, mas a leitura é inteiramente limitada à atividade de locomoção. Portanto, são discutidas abordagens combinatórias que abordam múltiplos parâmetros na triagem de novos candidatos a medicamentos, como uma leitura geral como atividade de locomoção combinada com uma leitura específica para o suposto modo de ação, como atividade eletrofisiológica ou metabólica [12].

Além da motilidade, a viabilidade dos nematóides pode ser avaliada utilizando corantes indicadores de atividade metabólica que são convertidos pelos estágios larvais em um produto mensurável. Diferentes indicadores metabólicos foram testados para helmintos, como o corante de tetrazólio brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), diacetato de fluoresceína (FDA), fosfato de para-nitrofenil (pNPP ) [34], e o corante permeável às células resazurina. A resazurina é baseada na redução dependente de NADPH da resazurina em resorufina e amplamente utilizada para monitorar o crescimento celular de mamíferos e o metabolismo celular em uma ampla gama de alvos [23]. O ensaio de redução de resazurina foi adaptado até agora para triagem de drogas em espécies adultas de Schistosoma [25, 26] e em larvas de quarto estágio (L4) e Trichuris muris adulto [39]. Até onde sabemos, os dados sobre o potencial do ensaio de redução da resazurina em Ascaris spp. parasitas está faltando, embora seja um dos HTS mais comuns em todo o mundo, tanto em humanos quanto em suínos [15, 17, 51].